lunes, noviembre 11, 2013

Glía promotora del crecimiento derivada de células madre neurales: un instrumento de reparación del trauma medular

 
Capítulo 5
 
 
 
 
 
 
9.  Diferenciación de neuroesferas a aldinoglía:
 
 
Las neuroesferas de meséncefalo de rata o ratón, normales o transfectadas con proteina fluorescente verde (GFP), proliferan rapidamente en medio NB27.  Las células disociadas de esas neuroesferas presentan morfología elipsoidal (Fig.8 a,c,d); capitulo 4.  Sin embargo, cuando son plaqueadas sobre un substrato adherente, emiten procesos, diferenciandose a progenitores neurales.  El destino final de estos progenitores depende tanto del substrato al que se adhieren, como de las señales presentes en el medio en el que se encuentran.  Si las células elipsoidales son plaqueadas sobre un substrato poco adherente (plástico para cultivo de bacterias, tratado con poli-lisina, PLL), las células se unen al substrato, emitiendo algunos procesos escasos y delicados.  Pero si una fracción substancial de NB27 (50 a 75 %) es substituido por este mismo medio condicionado por GE-BO, las células se adhieren y, tras unas 18 h en ese medio, asumen una forma similar a la aldainoglía (Fig. 8 b, e, f).  En esas condiciones, la diferenciación morfológica de las células no tratadas fué totalmente reversible: si las células se lavan e incuban en medio NB27 durante 18 h, recuperan la morfología esferoidal, agrupándose en agregados parecidos a neuroesferas (Fig. 8).  La exposición a medio condicionado por GE-BO, favoreció la adhesión al substrato de las células de neuroesfera, su aplanamiento y la emisión de procesos, induciendo además la expresión de los inmunomarcadores característicos de aldainoglía (Gudiño-Cabrera and Nieto-Sampedro 2000), como se detalla a continuación.
 

Figura 7.
10. El medio condicionado por Glia Envolvente de Bulbo Olfativo (GE-BO) guía a las neuroesferas hacia una expresión génica e inmunoreactividad similares a los de la aldainoglía:

Los genes expresados por las células de neuroesfera tras su cultivo en medio condicioned por GE-BO, durante 18 y 48 horas, fueron enviados al programa DAVID  (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) del National Institute of Health (NIH) de USA, para el diagnóstico de los procesos biológicos afectados.  Al menos 69 genes, implicados en diversas funciones celulares, fueron inducidos más de 2 veces en las células tratadas con medio condicionado por GE-BO (Tabla 1; Fig 9).  Gfap fué uno de los genes cuya expresión fué inducida más fuertemente (4.5 a 4.7 veces a 18 y 48 horas, respectivamente), indicando que las células de neuroesfera desarrollaron un claro fenotipo glial.  La expresión de GFAP en las células de neuroesfera adheridas, junto con la ausencia de cambios en la expresión de nestina, sugieren la aparición de un precursor neural de naturaleza glial (Merkle et al. 2004).  En trabajos previos planteamos la hipótesis de que la aldainoglía fuese un precursor de los distintos fenotipos neurales en el SNC (Gudiño-Cabrera y Nieto Sampedro, 1999, 2000), lo que nos llevó a examinar si las células diferenciadas de neuroesferas en medio condicionado por GE-BO, presentaban similitudes moleculares y funcionales con la aldainoglía.  Cuando comparamos los genes expresados por neuroesferas mantenidas en medio NB27 y por las mismas neuroesferas adheridas a PLL y expuestas a medio condicionado por GEBO (Tabla 1), la observación que más nos llamó la atención fué que las propiedades biológicas más afectadas por los genes sobreexpresados o reprimidos concernían al fenotipo celular (nestina, vimentina, GFAP, proteina S100, tubulina 3), a las propiedades inmunológicas y al crecimiento de neuritas (Tablas 1 and 2; Fig. 7).
 


Figura 8.

El fenotipo de glia promotora del crecimiento o aldainoglía está caracterizado por la expresión concomitante de inmunomarcadores específicos como GFAP periférica, receptor de estrógeno tipo y  receptor de neurotrofinas de baja afinidad p75 (Gudiño-Cabrera y Nieto-Sampedro 1999; 2000).  La exposición a medio condicionado por GE-BO de neuroesferas adheridas al substrato, indujo la aparición de esos inmunomarcadores en las células tratadas que, asimismo, experimentaron un cambio morfológico.  La inmunotinción para GFAP periférica co-localizó con las de receptor de estrógeno tipo alfa y de receptor de NGF de baja afinidad (Figs. 8).  El débil incremento en la expresión del gen Esr1, observada desde 18 a 48 horas (Tabla 1), se correlacionó con la aparición de inmunotinción para proteina receptora de estrógeno tipo alfa (Fig .8).  Similarmente, el descenso en la expresión de inmunoreactividad para el receptor de neurotrofinas p75 durante el cultivo, se correlacionó con la pérdida específica de RNA mensajero para esa proteína (Tabla 1; Fig. 8).


Figura 9.
 
 
 
10.1. Proteinas S100. 

 
Las proteinas S100, capaces de unir calcio, son marcadores consensuados de glía (Heizmann 1999). 
 
 
Las células disociadas de neuroesferas, adheridas al substrato mediante PLL, expresaron inmunoreactividad  para proteinas S100 tras 48 horas de exposición a medio condicionado por GE-BO (Fig 9), pero no a tiempos de exposición más cortos (18h, datos no mostrados).  La disminución en la expresión del RNA mensajero para S100a6 (calciclina, Tabla 1) indicó un ligero descenso en la transcription de S100a6 a tiempos de incubación más largos, mientras que el mensajero para S100a3 mostró un pequeño aumento a tiempos de incubación más cortos, comparado con el transcrito de S100b.  La isoforma de proteina S100b es común en células gliales (Donato 1999; Heizmann 1999) y su expresión tras 48 horas de cultivo fué consistente con el aumento observado en el mensajero del gen S100b (Tabla 1).

 
 La familia de proteinas S100, media la transducción de señales asociadas a Ca2+.  La distribución sub-celular de sus miembros cambia en respuesta a estímulos extracelulares.  Así, la expresión de los miembros de S100 implicados en inflamación y cura de heridas (Eckert et al. 2004) se incrementó poco en aldainoglía con respecto a las neuroesferas (Tabla 1).  La expresión de los genes S100a3 (Camby et al. 2000) y S100a6 (calciclina; Donato 1999), implicados en la proliferación celular benigna y en la progresión del ciclo celular, tampoco varió mucho.  Sin embargo, el producto del gen S100b, la proteina S100b, tipo “EF-hand” capaz de unir Ca2+, aumentó notablemente (-0.6 a +0.6).  S100b se une a la proteina ácida fibrilar glial (GFAP, la subunidad de los filamentos intermedios tipo III, específicos de células astrogliales), bloqueando el accesso de las proteinas quinasas a los sitios de fosforilación de GFAP e inhibiendo el ensamblaje a filamentos de la GFAP y la diferenciación neural (Sorci et al. 1998).  Como S100b estimula también la disociación de filamentos gliales regulada por Ca2 (Frizzo et al. 2004), se explica la normalización de los astrocitos reactivos inducida por el transplante de GE-BO en lesiones medulares (Verdú et al., 2001).  La expresión de los genes que codifican los monómeros de S-100b y GFAP, está regulada por la concentración intracelular de cAMP (Ziegler et al. 1998), lo que sugiere la manera en que la proteina S-100b regula el ensamblaje y distribución intracelular de los filamentos gliales.  El aumento con el tiempo en la expresión del gen S100b, comparado con los genes S100a3 and S100a6 (Tabla 1), junto con la inmunodetección de proteina S100b, apuntan a la aldainoglía como el primer paso en la difereciación de las células troncales neurales hacia su destino final, al menos en cultivo.
 
Tabla 1.

 
 
10.2.  Nestina y GFAP

 
Las células de neuroesfera, plaqueadas sobre un substrato adherente en medio condicionado por GE-BO, mostraron un aumento en la inmunoreactividad para GFAP comparado con células control.  Las inmunotinciones para nestina y GFAP co-localizaron pero, en contraste con GFAP, la expresión de nestina no mostró ninguna elevación con respecto a células no incubadas en medio condicionado (Fig.8).  La expresión del RNA mensajero del gen de nestina no fué afectada por la incubación en medio condicionado por GE-BO (Table 1), mientras que el RNA mensajero para GFAP aumentó casi 5-veces, justificando el aumento de inmunoreactividad observado.  El débil cambio en la expresión de Nes correlacionó con la abundancia, constantemente alta de su transcripto específico, que no se vió afectada por la incubación en medio condicionado por GE-BO (Tabla 1).

 
Los anticuerpos monoclonales y policlonales anti-GFAP mostraron claras diferencias de inmunoreactividad.   La ausencia de reacción de la proteina de los filamentos intermedios con el monoclonal anti-GFAP y su clara reacción con el anticuerpo policlonal (Fig 8), indicaron la presencia simultánea de estados de maduración de la proteina diferentes. El fuerte incremento en la expresión de mRNA para Gfap y la abundancia constante del transcripto de Nes a las 18 y 48 horas de cultivo, correlacionaron positivamente con la abundancia de sus correspondientes productos proteicos. La colocalización de ambas proteinas, nestina y GFAP, indicó un cambio en el citoesqueeleto hacia un fenotipo más maduro, el de un precursor con propiedades idénticas a la aldainoglía (Fig. 8, Tabla 1).

 
La presencia de inmunoreactividad para GFAP en células del SNC distintas de los astrocitos, detectada utilizando un anticuerpo policlonal de conejo contra GFAP, sin embargo no pudo ser confirmada utilizando un anticuerpo monoclonal.  La expresión alta del gen Gfap en células similares a aldainoglía, fué inducida por exposición de las neuroesferas a medio condicionado por GE-BO durante 18 y 48 horas (Tabla 1).  La abundancia de transcriptos del gen Gfap no concordaba con la ausencia de inmunotinción con el anticuerpo monoclonal en las neuroesferas no tratadas, aunque los anticuerpos policlonales detectaban claramente la presencia de GFAP tanto en las neuroesferas tratadas como en las no tratadas (Fig. 8).
 

 Para GFAP han sido descritos dos tipos de mRNA, que codifican proteinas de peso molecular casi idéntico, pero con una diferencia estructural importante (Feinstein et al. 1992): la GFAP de la glía periférica (GFAP-b) carece de una sequencia de 18 aminoácidos N-terminales, presente en GFAP de astrocitos (GFAP-a).  El anticuerpo monoclonal anti-GFAP (B2.2), fué preparado contra un péptido que contenía ese fragmento de18 aminoácidos (Lee VM-Y. and Shalaepfer, W.W.  1984) y reaccionó con astrocitos, pero no con células de Schwann (Feinstein et al. 1992).  Nuestros resultados indican que el anticuerpo monoclonal utilizado no detectó el producto de Gfap en células similares a aldainoglia, derivadas de neuroesferas incubadas en medio condicionado por GE-BO.