lunes, diciembre 02, 2013

Glía promotora del crecimiento derivada de células madre neurales: un instrumento de reparación del trauma medular


Capítulo 1
Tubulina bIII.







CAPITULO 6






10.3. Tubulina bIII


La tubulina bIII es la subunidad de los  microtúbulos específica de neuronas, ampliamente utilizada como marcador neuronal.  La baja señal para tubulina bIII observada en neuroesferas, aumentó ligeramente en las células resultantes de su plaqueo sobre polilisina (PLL), tras 18 horas de incubación en medio condicionado por GE-BO.  Esa baja expresión del gen se mantuvo a tiempos más largos (48h) de exposición a medio condicionado por GE-BO.  El receptor de estrógeno tipo a, un marcador de aldainoglía, colocalizó con tubulina bIII en las células de neuroesfera incubadas en medio condicionado por GE-BO.  Esa colocalización del marcador de aldainoglía con el marcador de neuronas tubulina bIII, indicó un papel general de precursor neural para esta población glial (Tabla 1, Fig 9).

Tabla 1.

10.4.  Antígenos de transplante MHC clases I y II

La expresión de los complejos mayores de histocompatibilidad, genes clases I y II, (MHC I y II) fué examinada utilizando análisis de DNA con microarrays e inmunocitoquímica. No se observó expresión de mRNA específico de los MHC en la aldainoglía derivada de neuroesferas, ni tras 18 horas, ni tras 48 horas de incubación de las neuroesferas en medio condicionado por GE-BO (Tabla 2).  Aunque en el caso del MHC clase I, los loci Aw2 and S3 son redundantes, no se detectó en ningún caso un cambio significativo en la expresión génica.  El aumento en la expresión de AF029241, correspondiente al gen RT1-S3, no fué incluido como un cambio de expresión, porque la fluorescencia basal casi no fué detectable.  Otros genes MHC examinados, de las clases Ia o Ib, no fueron afectados por la incubación con medio condicionado por GE-BO.

Tabla 2.
MHC, antígeno mayor de histocompatibilidad (major histocompatibility antigen). Las células de neuroesfera en cultivo fueron diferenciadas a células con morfología similar a la aldainoglía, por exposición a medio condicionado por glia envolvente del bulbo olfativo (GEBO), por los periodos de tiempo indicados.  El análisis con microarrays fué utilizado para examinar la expresión de genes respecto a los expresados por las células de neuroesferas.




El gen MHC de los mamíferos  está dividido en tres regiones, correspondientes a las clases I, II y  III.  La región clase I codifica moléculas clásicas I (clase Ia) y no clásicas I (clase Ib).  Las proteinas de la clase Ia estan implicadas en la presentación de antígeno a los linfocitos T, CD8 positivos, mientras que la función de los genes clase Ib no es conocida.  La región clase II codifica moléculas de la class II, implicadas en la presentación de antígeno a los linfocitos T, CD4 positivos.  Los genes de la clases I y II estan incluidos entre genes estructurales bien conservados, algunos de ellos esenciales para las respuestas inmunes adaptativas (procesado de antígeno y mecanismos de transporte de péptidos).  Los dos mRNAs específicos para los MHC clase II detectados en aldainoglia, no mostraron diferencias de expresión con respecto a las células control (Tabla 2). La inmunofluorescencia de los antígenos MHC-I y MHC-II, revelada con los monoclonales MRC OX-18 (Metzger et al. 2002) and MRC OX-6 (Gessl et al. 1995), respectivamente, fué similar al fondo (datos no mostrados).  Esta baja expresión de MHC en aldainoglia, observados tanto como mRNA o como proteina, se correlacionó con una expresión alta del transcripto de tolerancia TORID (tolerance-related and induced; Tabla 1).

 La region clase III contiene genes implicados en la inmunidad innata, como los componentes del complemento y las citoquinas (Hurt et al. 2004).  Como  fue observado previamente (Hori et al. 2003; Li et al. 2004), no pudimos detectar ni el mRNA específico para las clases I y II del MHC (Table 2), ni sus proteinas correspondientes.  Los genes MHC III no habían sido anotados cuando realizamos nuestros análisis con microarrays.  La baja antigenicidad, tanto de las neuroesferas como de la aldainoglía derivada de ellas en cultivo (baja expresión of MHC), junto con la alta expresión de TORID (Tabla 1), sugieren que las neuroesferas cultivadas y la aldainoglía derivada de ellas, podrían ser transplantadas en el SNC sin inmunosupresión o con inmunosupresión ligera.


 

Figura 9. Distribución de los genes expresados entre varias categorías funcionales. El  análisis por microarrays de los genes expresados después de 18 y 48 h de cultivo de neuroesferas en medio conditionado por GEBO; los genes expresados fueron enviados a DAVID (Data Base for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) para encontrar los procesos biológicos afectados por el tratamiento con el medio condicionado. A la derecha se indica el número de genes afectados para cada categoría funcional.




11.  Promoción del crecimiento neurítico por aldainoglia derivada de neuroesferas 

Las funciones de los tipos macrogliales, como tanicitos, pituicitos y GE-BO, incluyen la promoción del crecimiento de axones y su envoltura rápida y reversible.  Estas propiedades, similares a las de las células de Schawnn, sugieren su agrupamiento en una clase funcional que hemos llamado aldainoglia (Nieto-Sampedro, 2002).  La notable capacidad de la aldainoglía derivada de neuroesferas para promover el crecimiento de neuritas , se puso de manifiesto cuando estas células fueron co-cultivadas con neuronas de ganglio raquídeo (Fig. 10).  La aldainoglía promovió el crecimiento y asociación de las neuritas, para formar fascículos más largos y gruesos que los observados en los ganglios control (Fig 10).  La fasciculación de las neuritas podría explicarse por la sobre-expresión de la molécula de adhesión ICAM-1 (Tabla 1).  Las células de neuroesfera tratadas con medio condicionado por GE-BO promovieron con efectividad el crecimiento de neuritas de las neuronas ganglionares, lo que, junto con la expresión de los marcadores inmunológicos descritos ( Fig.11), justifican llamar aldainoglia a las células derivadas de neuroesfera. 

 Las neuroesferas plaqueadas sobre un substrato adherente y expuestas a los factores solubles presentes en el medio condicionado por GE-BO, se diferenciaron a células similares a aldainoglía (Doncel y col., 2009).  La cuestión es cuales son los factores de crecimiento que regulan esa diferenciación de las neuroesferas.  Por el momento, el candidato más plausible parece ser un factor de crecimiento de la familia de la neuregulina, NRG-1, actuando a través de su receptor específico, una tirosina quinasa (Burden and Yarden 1997; Carraway and Burden 1995).
 

Figura 10. (Arriba). Crecimiento neurítico en Ganglios de la raíz dorsal de rata cultivados sobre (a, b) poli-L-lisina, (c, d) sobre aldainoglía de rata y (e, f) sobre aldainoglía de ratón. Tinción nuclear con Hoescht (azul: a, c y e) y con anticuerpo contra neurofilamentos (rojo. b, d y f). Las gráficas a la derecha muestran la comparación en el crecimiento neurítico de las neuronas de los ganglios en las tres condiciones.  (Abajo). Promoción del crecimiento neurítico de ganglios de la raíz dorsal de rata, co-cultivados con aldinoglia derivada de neuroesferas. Los ganglios de embiones de rata (E15), fueron cultivados en ausencia (fila superior) o sobre células de aldinoglia (fila inferior). Los cultivos celulares fueron fijados e inmunoteñidos con anticuerpo policlonal anti-neurofilamento. Barra de aumento 100 µm.


11.1.  La aldainoglía derivada de neuroesferas envuelve neuritas, promoviendo su fasciculación y mielinización

Células similares a aldinoglía, obtenidas por diferenciación de neurosferas, incubándolas en una mezcla de medio NB27 y medio condicionado por GE-BO durante 24h , se adhirieron  fuertemente al substrato de cultivo y promovieron el crecimiento in vitro de neuritas de neuronas de ganglio raquídeo (DRG; Fig. 10 e*, f*, g*, h*). El medio de cultivo de células derivadas de neurosferas fué eliminado y DRG aislados de embriones de rata de 15 días, fueron co-cultivados con las células similares a aldinoglía. Las neuronas DRG, plaqueadas en cubres de vidrio junto con células derivadas de neurosferas durante 5 días, desarrollaron un halo neurítico de diámetro 2.5 veces más grande que DRGs mantenidos en medio control (Fig.10). El  incremento en el crecimiento neuritico de neuronas DRG con respecto a los controles, causado por la aldinoglía de rata o ratón, fué significativo (P < 0.01). La velocidad media de crecimiento neuritico aumentó desde 0,4 mm/día en medio control a 1,1 mm/dia en presencia de aldinoglía derivada de neurosferas. Las células derivadas de neurosferas mostraron propiedades de promoción del crecimiento neuritico similares a las de la GE-BO o a las células de Schwann. Además, las neuritas de DRGs promovidas por aldainoglía derivada de neurosferas, aparecieron enpaquetadas en fascículos más gruesos (Fig. 10  f*, g*, h*) que las neuritas formadas en medio control (Fig. 10 b*, c*, d*) .

Figura 11. Las células derivadas de neuroesferas presentaron los marcadores inmunocitoquímicos característicos de la aldainoglía.  Las neuroesferas fueron cultivadas sobre substrato tratado con polilisina en medio conditionado por GEBO, fijadas e inmunoteñidas. La figura muestra fluorescencia roja para b) inmunotinción para receptor de estrógeno typo a;f) proteina S100; y j) receptor de neurotrofinas de baja afinidad, p75. Con inmuno fluorescencia verde inmunotiñen las proteinas de citoesqueleto: c), Nestina, g),Vimentin and k), GFAP. Los núcleos fueron contrateñidos con Hoechst (flurescencia azul).  Los paneles  d) y h) muestran co-localización celular de los antígenos.  Las células fueron incubadas en medio condicionado durante 48 horas, excepto la tinción para GFAP (5 días). Los paneles a, e. i, l, muestran en contraste de fase las células teñidas.  Barra de aumento, 100 µm.


        La aldainoglía derivada de neuroesferas cultivada con DRGs, expresó antígeno O1 (Fig. 12; Boyd  et al., 2005; Doucette and Devon 1995), como las células de Schwann de los DRG  y la aldainoglía in situ o en cultivo primario (Gudiño-Cabrera and Nieto-Sampedro, 2000). La expresión de antígeno O1 por células que envuelven neuritas (Fig.12f ), indica la preparación para mielinizar (Doucette and Devon, 1995; Gudiño- Cabrera and Nieto-Sampedro 2000; Boyd et al., 2005). La interacción de células pre-mielinizantes O1-positivas (células de Schwann o aldainoglía derivada de neurosferas) con neuritas de DRG, fué observada mediante tinción imunocitoquímica doble, con O1 y anticuerpo policlonal de conejo, anti-neurofilamento (Fig. 12 c, g ).  El diámetro de las fibras envueltas por células O1-positivas, aumentó desde 3-4 μm en DRGs control hasta 14-16 μm en células cultivadas con aldainoglía derivada de neurosferas (Fig. 12). La superficie de las neuritas de DRG envueltas por células de Schwann o aldainoglía, áreas de tinción doble para O1 y neurofilamento, fué visualizada y medida con ayuda del programa Image J del NIH.  Estas áreas, expresadas como número de pixels comunes, se muestran en una gráfica de barras en la Fig. 12.  La presencia de aldainoglía causó un incremento de 1,5 veces en la superficie de fibras neurofilamento-positivas envueltas por células mielinizantes, comparada con DRGs control.
 

Figura 12. Co-cultivos de ganglio raquídeo con células de aldainoglía derivadas de neuroesfera. Los ganglios de embriones de rata (E15), fueron cultivados en ausencia (fila superior) o sobre células de aldinoglia (fila inferior).  Los cultivos celulares fueron fijados e inmunoteñidos con anticuerpo monoclonal anti-antígeno O1 (b, f; fluorescencia verde) y anticuerpo policlonal anti-neurofilamento (c, g; fluorescencia roja). El área de colocalización de ambas tinciones (color amarillo),fué identificada con ayuda del programa de análisis de imagen para Windows, ImageJ y codificada (d, h, color blanco). En el panel inferior izquierdo están representada las zonas neuríticas de co-localización y el área neurítica donde se expresa el antígeno O1 en cultivo control y en el co-cultivo.  El área de los cuerpos ganglionares (*,ganglio raquídeo) no fué incluida en el análisis. Barra de aumento 100 µm.